Estudo dos polimorfismos C1236T, G2677T e C3435T do gene MDR1 em pacientes portadores de doenças inflamatórias intestinais

Estudos recentes têm avaliado a presença de polimorfismos do gene multidroga resistente 1 (MDR1), que codifica o transportador de membrana de efluxo chamado de P-glicoproteína, seu potencial papel na suscetibilidade das doenças inflamatórias intestinais (DII) e suas possíveis correlações com aspectos clínicos das DII. Dados conflitantes podem resultar da análise genética de populações distintas. Investigamos se os polimorfismos do gene MDR1 estão associados com as DII em população do sudeste do Brasil e suas possíveis correlações com fenótipos, atividade de doença, resposta ao tratamento e efeitos colaterais. Como métodos, a presente pesquisa trabalhou com 146 pacientes com Doença de Crohn (DC) e 90 com Retocolite Ulcerativa Idiopática (RCUI), que foram recrutados através de critérios diagnósticos estabelecidos. Os polimorfismos do MDR1 mais comumente descritos na literatura, C1236T, G2677T e C3435T, foram avaliados por PCR. As frequências genotípicas de pacientes com RCUI e DC foram analisadas na população de estudo. Associações de genótipo-fenótipo com características clínicas foram estabelecidas e riscos estimados para as mutações foram calculados. Nenhuma diferença significativa foi observada nas freqüências genotípicas para os polimorfismos G2677T/A e C3435T do MDR1 na DC ou na RCUI. O polimorfismo C1236T foi significativamente mais comum na DC do que na RCUI (p = 0,036). Na RCUI foram encontrados mais homens nos polimorfismos C1236T e G2677T no grupo de heterozigotos. Foram encontradas associações significativas entre o polimorfismo C3435T do gene MDR1 em pacientes com fenótipo estenosante na DC (OR: 3,16, p = 0,036), em oposição ao comportamento penetrante (OR: 0,31, p = 0,076). Na DC, associações positivas também foram encontradas entre o polimorfismo C3435T, à atividade moderada/severa da doença (OR: 3,54, p = 0,046), e à resistência / refratariedade ao corticosteróide (OR: 3,29, p = 0,043) nos homozigotos polimórficos. Nenhuma associação significativa foi encontrada entre os polimorfismos do MDR1 e categorias fenotípicas, atividade de doença ou resposta ao tratamento da RCUI. Em conclusão, os resultados do presente estudo sugerem que os polimorfismos do gene MDR1 poderiam estar implicados na susceptibilidade a DC e no seu fenótipo estenosante, como também estarem associados com uma resposta inadequada ao tratamento em um grupo de pacientes com DC. A forte relação com a DC suporta a existência de papéis adicionais para o MDR1 em mecanismos específicos subjacentes na patogênese da DC, como o controle da microbiota intestinal, mediação e regulação da fibrose. Além disso, compreender os efeitos de vários fármacos associados a estas variantes do MDR1 pode contribuir para a prescrição personalizada de regimes terapêuticos.

Óleo de peixe (fonte de ácidos graxos n-3) atenua inflamação das vias aéreas e hiper-reatividade pulmonar induzida por alérgeno em camundongos

O óleo de peixe é rico em ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) n-3 e vem sendo apontado como anti-inflamatório associado à melhora de diversas doenças de natureza inflamatória. No presente estudo, objetivou-se avaliar a influência do óleo de peixe sobre a inflamação pulmonar e hiper-reatividade em camundongos ativamente sensibilizados desafiados com ovoalbumina (OVA). Camundongos A/J machos foram alimentados com dieta standard-chow (SC) ou dieta rica em óleo de peixe (Px) durante 8 semanas. Após 4 semanas do início da dieta, cada grupo foi subdividido aleatoriamente para ser desafiado com salina (SC-SAL e PX-SAL) ou ovoalbumina (SC-OVA e PX-OVA). A função pulmonar (resistência e elastância) foi avaliada através de pletismografia invasiva, na condição de aerolização ou não com metacolina 24 horas após o último desafio antigênico. Foi realizado lavado broncoalveolar (LBA) para contagem de leucócitos e quantificação de eotaxina-2. A deposição de muco e de matriz peribronquiolar e o infiltrado de eosinófilos foram quantificados no tecido pulmonar. Foram avaliados interleucina (IL)-13 através de imunohistoquímica e NFκB, GATA-3 e PPARγ, por western-blotting. O desafio com OVA resultou em aumento da infiltração de eosinófilos, elevada produção de citocinas inflamatórias, remodelamento pulmonar, produção de muco e hiper-reatividade das vias aéreas. Detectou-se aumento na expressão dos fatores de transcrição NFκB e GATA-3 nos camundongos do grupo sensibilizado e desafiado com OVA em comparação aos controles. Todas essas alterações foram atenuadas nos camundongos que receberam dieta com óleo de peixe. Expressão elevada de PPARγ foi detectada nos pulmões dos camundongos dos grupos alimentados com óleo de peixe. Em conclusão, nossos resultados mostram que a ingestão de óleo de peixe atenuou as características clássicas do quadro asmático através da modulação da síntese de mediadores inflamatórios, via regulação negativa de NFκB e GATA-3 e regulação positiva de PPARγ. O óleo de peixe parece ser uma terapia alternativa para o controle e tratamento da asma.

Curta administração de GW501516 melhora o estado inflamatório do tecido adiposo branco, o dano hepático e a inflamação renal de camundongos alimentados com dieta rica em frutose

A superativação do eixo ECA/AT1r está intimamente relacionada à síndrome metabólica e no organismo tem grande relação com o quadro de inflamação. A administração de frutose, seja por dieta ou pela água, tem sido usada como um modelo para a indução da superatividade desse eixo e para o estudo das vias inflamatórias relacionadas ao AT1r. Com isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar se a administração de GW510156 poderia diminuir a superativação do eixo ECA/AT1r e consequentemente diminuir os danos causados pela dieta rica em frutose. Para isso foram utilizados camundongos machos C57Bl/6 que receberam uma dieta contendo 47% de frutose durante oito semanas ou uma dieta controle. Após oito semanas, os grupos foram redivididos aleatoriamente para o início da administração do GW501516 durante três semanas, totalizando quatro grupos experimentais. Os animais tratados apresentaram uma melhora da pressão arterial sistólica e também dos parâmetros urinários como proteinúria e ácido úrico. Houve ainda uma melhora dos triglicerídeo e ácido úrico plasmáticos. No tecido adiposo branco, o GW501516 foi capaz de diminuir a expressão dos componentes do eixo ECA/AT1r e também amenizou a inflamação causada pela dieta rica em frutose. No fígado, não houve alterações significativa do eixo, porém a fosforilação de JAK2 dependente de AT1r foi diminuída e consequentemente houve uma menor ativação das células estreladas no grupo que recebeu o GW501516. Além disso, as proteínas e genes relacionados à β-oxidação foram aumentados com o tratamento e aqueles relacionados à lipogênese de novo, diminuídos o que resultou em menor esteatose no parênquima hepático. Os rins apresentaram uma melhora da inflamação induzida pelo eixo, apesar de o eixo também não ter apresentado diferenças significativas com o tratamento. Também não foram encontradas diferenças significativas na expressão proteica e gênica das proteínas antioxidantes. Com esses resultados podemos concluir que a curta administração do GW501516 pôde aliviar os efeitos inflamatórios e a esteatose hepática causada pela dieta rica em frutose, podendo ser pensado como uma nova ferramenta terapêutica no tratamento da superativação do eixo ECA/AT1r.

Efeito do tratamento com a proteína quimérica IL-13PE sobre a inflamação pulmonar induzida por partículas de sílica em camundongos

A interleucina 13 (IL-13) tem sido apontada como um dos principais mediadores em processos de ativação de fibroblastos e indução de fibrose pulmonar, sendo, portanto, considerada como um alvo terapêutico importante. A silicose é uma doença pulmonar inflamatória crônica, de caráter ocupacional, caracterizada por uma intensa resposta fibrótica e granulomatosa. Com base nestas observações, tivemos por objetivo investigar o potencial efeito da administração da imunotoxina IL-13-PE38QQR (IL-13PE) sobre o modelo de silicose em camundongos. Camundongos Swiss-Webster foram anestesiados e instilados intranasalmente com partículas de sílica (10 mg), sendo a administração da IL-13PE (200ng/dia) realizada por via intranasal, uma vez ao dia em dias alternados no período entre 21 a 27 dias após a provocação. Analisamos o componente inflamatório, a deposição de colágeno e a área de granuloma avaliados através de técnicas clássicas de histologia, incluindo coloração com H&E e Picrus-sirius, ou ainda a quantificação do conteúdo de colágeno por Sircol. Os componentes de matriz extracelular fibronectina e laminina foram avaliados através de imunohistoquímica. Citocinas e quimiocinas foram quantificadas por sistema de ELISA. As medidas de função pulmonar e resposta de hiperreatividade foram realizadas através do sistema de pletismografia de corpo inteiro invasiva. Verificamos que o tratamento curativo com a IL-13PE inibiu de forma acentuada o comprometimento da função pulmonar nos camundongos silicóticos, incluindo tanto aumento da resistência como da elastância, assim como a resposta de hiperratividade das vias aéreas ao agente broncoconstrictor metacolina. De forma coerente, os animais silicóticos quando submetidos ao tratamento com IL-13PE apresentaram marcada redução do componente inflamatório pulmonar e da resposta fibrótica, atestado pela diminuição na produção de colágeno, laminina e fibronectina e redução importante da área de granuloma. De forma semelhante, as citocinas (TNF-α e TGF-) e quimiocinas (MIP-1α, MIP-2, TARC, IP-10, MDC) detectadas em quantidade aumentada no pulmão de animais silicóticos foram reduzidas pelo tratamento com a IL-13PE. Em conclusão, nossos resultados mostram que a administração curativa da IL-13PE foi capaz de inibir os componentes inflamatórios e fibróticos da fase crônica do quadro silicótico em camundongos, o que se refletiu de forma clara na melhora da função pulmonar. Em conjunto, nossos achados indicam que a utilização da IL13PE parece constituir uma abordagem terapêutica extremamente promissora para aplicação em casos de doenças crônicas de natureza fibrótica como a silicose.

Função pulmonar, estresse oxidativo e marcadores inflamatórios na lesão pulmonar aguda induzida por lipopolissacarídeo: diferentes efeitos da atorvastatina, pravastatina e simvastatina

Nosso objetivo foi determinar que tipo de estatina pode atenuar a lesão pulmonar aguda (LPA) induzida por lipopolissacarídeo (LPS) em camundongos da linhagem C57Bl/6. Trinta camundongos machos ( 23 g) foram divididos em 5 grupos (n=6 cada): grupo LPS (10 mg/kg) administrado intraperitonealmente (i.p.), LPS mais atorvastatina (10 mg/kg/dia; grupo LPS+A), LPS mais pravastatina (5 mg/kg/dia; grupo LPS+P) e LPS mais sinvastatina (20 mg/kg/dia; grupo LPS+S). O grupo controle recebeu salina i.p.. Em um grupo separado de camundongos (n=5), a soma das pressões pulmonares resistivas e viscoelásticas (DeltaPtot) e elastância estática (E[st]) foram medidas. Um dia após a administração de LPS os camundongos foram sacrificados (24 h) por deslocamento cervical e logo em seguida foi realizado lavado broncoalveolar (LBA). Os pulmões foram removidos para análise histopatológica e homogeneizados para análises bioquímicas (ELISA, catalase, superóxido dismutase, mieloperoxidase, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, carbonilação de proteínas e método de Griess). A quantidade de leucócitos foi menor no grupo LPS+P (p<0,01) e LPS+S (p<0,05) em comparação ao grupo LPS. Os níveis de MCP-1 e IL-6 reduziram no grupo LPS+P (p<0,01), enquanto o grupo LPS + S mostrou redução apenas nos níveis de IL-6 (p<0,05) em comparação ao grupo LPS. Marcadores redox (superóxido dismutase e catalase) foram menores no grupo LPS+A (p<0,01) em comparação ao grupo LPS. A peroxidação lipídica (malondialdeído e hidroperóxidos) diminuiu em todos os grupos tratados (p<0,05) quando comparados ao grupo LPS. A mieloperoxidase foi menor no grupo LPS+P (p<0,01) quando comparado ao grupo LPS. DeltaPtot e E(st) foram, significativamente, maiores no grupo LPS do que nos outros grupos. Nossos resultados sugerem que atorvastatina e pravastatina, mas não a sinvastatina, exibiram ações anti-inflamatórias e antioxidantes na LPA induzida por LPS.

Estudo dos componentes metabólicos, hormonais, marcadores inflamatórios e função microvascular em crianças com excesso de peso

Estudos da microcirculação cutânea demonstram que a disfunção microvascular neste sítio está relacionada a diversos fatores de risco cardiovascular. Existem poucos estudos avaliando a reatividade microvascular em crianças e a interferência da puberdade está presente na maioria deles. O objetivo deste estudo foi avaliar se a disfunção microvascular está presente em crianças pré-púberes com excesso de peso através da técnica de videocapilaroscopia de leito periungueal. Realizou-se um estudo transversal com 52 obesos, 18 sobrepesos e 28 eutróficos, com idade de 7,44 1,22 anos. Avaliou-se o comportamento dos fatores de risco e a função microvascular. A reatividade microvascular foi testada através da avaliação da densidade capilar funcional, da velocidade de deslocamento das hemácias em repouso e após uma isquemia de 1 min, e do tempo de reperfusão durante a hiperemia reativa. Análise de função disciminante canônica foi utilizada de forma multivariada para testar a possibilidade de separação dos grupos conforme o grau de adiposidade. Nos pacientes estudados não observamos diferença na reatividade microvascular, em nenhuma da variáveis testadas. Conforme esperado, os grupos obeso e sobrepeso apresentavam maiores valores para a circunferência da cintura (p<0,001), a relação cintura/altura (p<0,001), a pressão arterial média (p<0,001), o homeostasis model assessment for insulin resistance (HOMA-IR) (p<0,001) e os níveis de insulina (p<0,001), leptina (p<0,0001), glicose (p=0,02), triglicerídeos (p<0,05), colesterol total (p=0,004), ácido úrico (p=0,007) e proteína C reativa (p<0,0001) do que os eutróficos. A análise multivariada demonstrou a associação de variáveis metabólicas, antropométricas e microvasculares, sendo que estas foram separadas pelo grau de adiposidade corporal. Concluímos que nessa população estudada, apesar das diferenças nos perfis metabólico, inflamatório e hormonal, não houve diferença na reatividade microvascular. Entretanto, a associação entre variáveis clínico-antropométricas com aquelas relacionadas com a reatividade microvascular esteve presente nestas crianças pré-púberes e o grau de adiposidade corporal foi capaz de influenciar estas associações.

Avaliação de marcadores biológicos com potencial para detecção da evolução para doença em tuberculose

A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa obtida a partir da inalação de aerossóis contendo seu agente etiológico, o Mycobacterium tuberculosis. A TB acomete principalmente os pulmões e é a patologia bacteriana líder em causar mortes no mundo. No Brasil, por ano, são notificados 69 mil casos de tuberculose, dos quais 4,6 mil evoluem para o óbito. Durante a infecção pelo M. tuberculosis, 90% dos indivíduos permanece na forma latente assintomática, e aproximadamente 10% evolui para doença. Este trabalho estudou parâmetros de resposta imune e inflamatória, em indivíduos de ambos os sexos, com idades de 18 a 65 anos, com diferentes graus de exposição ao M. tuberculosis (indivíduos não-expostos ao M. tuberculosis, TST < 5 mm, n= 30; indivíduos com tuberculose latente, TST &#8805; 5 mm, n=29; pacientes com tuberculose pulmonar n= 22). Nossos resultados mostraram que o TST isoladamente falhou em detectar todos os indivíduos expostos ao M. tuberculosis, e em 1/3 dos TST positivos não foi observada resposta in vitro a antígenos específicos de M. tuberculosis, avaliada com os biomarcadores IFN-&#947; e CXCL10. Houve uma alta correlação entre os biomarcadores IFN-&#947; e CXCL10 em culturas de sangue não fracionado estimuladas com antígenos específicos de M. tuberculosis. A utilização combinada destes 2 biomarcadores mostrou positividade para M. tuberculosis em 94,4% dos pacientes. Foram observadas diferenças marcantes de nível de expressão de RNA mensageiro específicos para CD64, GTPase associada a Ras, lactoferrina, PDL-1 e CXCL10, mas não para OASL em leucócitos sanguíneos, quando os pacientes com tuberculose pulmonar foram comparados com os dois outros grupos de voluntários. Da mesma forma, os níveis de expressão dos receptores CD64 e CD163 foram significativamente mais elevados em neutrófilos dos pacientes quando comparados com os grupos-controle. Tomadas em conjunto, nossas observações sugerem que o uso de mais de um biomarcador aumenta a sensibilidade e especificidade dos métodos para detecção de infecção latente por M. tuberculosis e tuberculose.

Estudo do potencial anti-inflamatório e antiartrítico de Pterodon polygalaeflorus e dos seus mecanismos de ação

O gênero Pterodon pertence à família das Fabaceae e inclui quatro espécies nativas do Brasil: P. emarginatus Vog., P. apparicioi Pedersoli, P. abruptus Benth. e a espécie objeto deste estudo P. polygalaeflorus Benth.. Seus frutos são utilizados pela medicina popular devido às propriedades antirreumática, analgésica, anti-inflamatória, dentre outros. O objetivo deste trabalho foi avaliar a espécie Pterodon polygalaeflorus quanto ao seu potencial anti-inflamatório, antiartrítico e toxicológico, através da análise de seus efeitos em modelos in vitro e in vivo. Os extratos EEPpg, EHPpg e EDPpg reduziram (p<0,01) a produção in vitro de NO, por macrófagos ativados por LPS, com baixa citotoxicidade e diminuíram a celularidade (p<0,05) no exsudato inflamatório no modelo de inflamação in vivo conhecido como air pouch. O extrato mais ativo (EHPpg) foi selecionado e submetido a fracionamento em coluna de sílica gel 60 gerando quatro frações. Todas as frações (Fr I-Fr IV) reduziram: a produção de NO (p<0,001) por macrófagos ativados, com baixa ou nenhuma citotoxicidade; a migração de macrófagos in vitro (p<0,01, ensaio de wound healing) e in vivo (p<0,05, peritonite induzida por tioglicolato); e a proliferação de esplenócitos estimulados com Con A (p<0,001). As frações III e IV, mais ativas nos ensaios anteriores, mostraram ação antiartrítica (com 0,02 mg/kg), utilizando o modelo in vivo de artrite induzida por adjuvante completo de Freund (AIA), demonstrada por redução: do índice de edema de pata em 23,7% (Fr III) e 43,95% (Fr IV); das lesões histopatológicas na região tíbio-tarsal típicas de articulações com AIA (p< 0,05); do peso e celularidade do linfonodo e do baço, mas não da celularidade da medula óssea; das subpopulações de linfócitos (CD4+, CD8+ e CD19+) nos linfonodos inguinais, porém com significativo aumento das subpopulações ativadas CD4+CD69+, redução da CD8+CD69+ e aumento de CD19+CD69+ (apenas na Fr III); e redução da população de macrófagos no baço (p<0,001). As frações III e IV mostraram ação imunossupressora em nível celular e molecular, reduzindo (p<0,001) os níveis do mRNA da iNOS, assim como as citocinas IL-1&#946;, TNF-&#945; e IL-10, em nível de mRNA e proteína, em cultura de macrófagos. A expressão do receptor CD14, em macrófagos estimulados por LPS (31,74%), foi inibida apenas pela Fr III. A osteoclastogênese foi inibida pelas frações III e IV, sugerindo uma ação antiartrítica das frações em nível de diferenciação celular para osteoclastos (inibição). Este efeito pode resultar da inibição da expressão do fator de transcrição NFATc1, no caso da Fr III. Por fim, as frações Fr III e Fr IV não apresentaram toxicidade subaguda, potencial mutagênico (teste de Ames) ou genotóxico (teste do micronúcleo). A ausência de toxicidade in vivo das frações ficou demonstrada pela ausência de alteração no peso corporal e de órgãos, nas concentrações séricas de creatinina, ácido úrico, triglicerídeos, colesterol, ALT e ALP, ou de CYP1A1 e GSTs no fígado. Análises fitoquímicas (GC-MS e TLC) mostraram uma grande variedade de terpenos nas frações III e IV, sendo majoritários os furano-diterpenos derivados do vouacapano. O diterpeno isolado, Ppg-01, presente nas frações III (5,12%) e IV (18,47%), reduziu a produção in vitro de NO e o edema de pata induzido por carragenina (p<0,001). Em conjunto, os dados sugerem que o Ppg-01 esteja contribuindo para as ações anti-inflamatórias e imunomoduladoras das frações III e IV, e que estas propriedades estejam associadas aos efeitos antiartríticos observados.

Avaliação do efeito anti-inflamatório e antiasmático da 15-deoxy-delta-12,14-prostaglandina J2 em modelos murinos de asma

A asma é um distúrbio crônico pulmonar caracterizado por inflamação, obstrução e remodelamento brônquico, levando a sintomas como sibilo, tosse e falta de ar. A terapia antiasmática consiste em corticosteroides inalados e agonistas &#946;2 de curta ou longa duração. O tratamento é limitado por efeitos colaterais e refratariedade de alguns pacientes, justificando a necessidade de novas terapias. Estudos demonstram que a 15-deoxy-delta- 12,14-prostaglandina J2 (15d-PGJ2), um ligante endógeno de receptores ativados por proliferadores de peroxissomos do tipo gama (PPAR-&#947;), é capaz de reduzir a expressão de citocinas pró-inflamatórias, o que pode resultar em benefícios no tratamento de doenças com esse perfil. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial anti-inflamatório e antiasmático da 15d-PGJ2 em modelos experimentais de asma. Camundongos A/J machos foram sensibilizados nos dias 0 e 7 através de injeção subcutânea (s.c.), contendo ovoalbumina (OVA) e Al(OH)3, e desafiados com 4 instilações intranasais (i.n.) de OVA em intervalos semanais. O tratamento com 15d-PGJ2 (30 e 100 &#61549;g/Kg, s.c.) foi realizado 30 min antes dos desafios a partir da terceira provocação antigênica. Em outro modelo, camundongos A/J foram desafiados intranasalmente com extrato de ácaro 3 vezes por semana durante 3 semanas. As administrações de 15d-PGJ2 (30, 70 e 100 g/Kg, s.c. e 0,65; 1,5 e 2,3 g/animal, i.n.) foram realizadas a partir da 3 semana, 30 min antes dos desafios. As análises ocorreram 24 h após o último desafio. Nossos resultados mostraram que, em camundongos previamente sensibilizados e desafiados com OVA, a administração de 15d-PGJ2 limitou significativamente o influxo peribrônquico de eosinófilos e neutrófilos, bem como a produção de muco por células caliciformes e fibrose sub-epitelial, além da hiperreatividade das vias aéreas e produção de IL-5. A redução do epitélio brônquico e das citocinas IL-13 e TNF-&#945; foram observadas somente na maior dose administrada. No modelo HDM a inflamação e o remodelamento foram atenuados em todas as doses administradas do composto, enquanto que a hiperresponssividade brônquica foi inibida apenas nas doses de 70 e 100 &#956;g/Kg (via sistêmica) e na dose intermediária dada topicamente (1,5 &#956;g/animal, i.n.). Os níveis de citocinas foram atenuados pelo tratamento subcutâneo, porém somente os níveis de IL-17, eotaxina-1 e TNF-&#945; foram inibidos com a dose intranasal de 0,65 g/animal. O aumento da expressão de NF-&#954;B, induzido por provocação com HDM também foi reduzido significativamente pela administração de 15d-PGJ2. Em conjunto, nossos dados indicam que o tratamento com 15d-PGJ2 inibe alterações cruciais associadas à patogênese da asma, em modelos experimentais distintos da doença, demonstrando possuir grande potencial para controlar e reverter inflamação, hiperreatividade e remodelamento pulmonar desencadeados por provocação alérgica.

Estudo do perfil salivar proteico de crianças obesas pré-púberes com foco nas alterações de mediadores da metainflamação

O objetivo deste estudo foi investigar na saliva de crianças pré-púberes obesas, em comparação com crianças eutróficas, a presença de possíveis diferenças na expressão de mediadores proteicos relacionados à metainflamação através de um estudo observacional transversal. Foram selecionadas 105 crianças pré-púberes com idade entre 5 e 9 anos, sem quaisquer outros comprometimentos sistêmicos ou bucais sendo realizada a mensuração do comprimento da circunferência da cintura (CC), além do peso e estatura para cálculo do IMC e seu escore Z (zscore IMC), de forma a compor 3 grupos: EU - eutrofia (-2SD&#8804; zscore IMC&#8804;1SD), SP - sobrepeso (1SD < zscore IMC < 2SD) e OB obesidade (zscore IMC &#8805; 2SD). Após o exame médico e odontológico foi feita a coleta de sangue e de saliva total não estimulada, de forma protocolada. Amostras séricas e salivares foram analisadas, individualmente, para a dosagem de IL1&#946;, IL6, IL8. IL10, IL12p70, TNF&#945;, MCP1, leptina, grelina e insulina, por Multiplex e adiponectina total e de alto peso molecular (adipoHMW), por ELISA. Além disso, as amostras séricas foram utilizadas para o delineamento hemodinâmico dos pacientes. As amostras salivares de EU e OB foram também analisadas em pools por espectrometria de massa (MS) e a presença de algumas proteínas foi validada por imunoblotting, para a comparação do perfil salivar proteico. As concentrações dos analitos foram comparadas tanto entre os grupos (teste de Kruswall-Wallis), como em relação ao zscore IMC e ao CC (Correlação de Spearman ou Pearson). Dos 12 analitos, somente a adipoHMW não foi detectada em nenhuma das amostras salivares. Na comparação OBxEU houve aumento na concentração total de proteínas salivares, da insulina e leptina sérica e salivar e do MCP1, além de diminuição da adiponectina sérica total e de adipoHMW e uma menor relação adiponectina/leptina (A/L) no grupo OB. As principais correlações obtidas com o zscore IMC foram com as concentrações séricas e salivares de insulina e leptina (positivas) e com a relação A/L (negativa), observando-se também a correlação negativa com a adiponectina total e adipoHMW séricas. Na comparação entre as concentrações séricas e salivares, foi possível detectar correlação positiva entre as dosagens de insulina e leptina, assim como com os valores da relação A/L. Na análise proteômica por MS foram identificadas 670 proteínas, sendo 163 delas com expressão diferenciada na saliva de OB em relação a EU. Dentre estas, encontram-se alteradas proteínas relacionadas à resposta inflamatória humoral, em especial com a via alternativa do sistema complemento e do metabolismo redox. Foram selecionadas três destas proteínas para validação por imunoblotting, que confirmou o aumento do Fator H e a diminuição do Fator B e da tioredoxina na saliva de OB em relação a EU. Considerando os resultados, podemos verificar que embora com menores concentrações absolutas dos mediadores, a saliva mostrou praticamente as mesmas associações observadas no sangue, em especial para a insulina, leptina e relação A/L, sendo possível admitir que a análise salivar venha a ser um bom método diagnóstico não invasivo para a obesidade infantil.

Efeito do Sistema de Secreção do Tipo VI de <i>Pseudomonas aeruginosa</i> em modelo murino de pneumonia aguda

O Sistema de Secreção do Tipo VI (SST6), o mais recente maquinário de secreção descrito em bactérias Gram-negativas, é amplamente distribuído entre as diversas espécies deste grupo de microrganismos. Esse aparato de secreção é capaz de injetar efetores proteicos em células alvo, eucarióticas e procarióticas. Estudos sobre o papel do SST6 na virulência microbiana revelaram que este sistema secretório participa ativamente do estabelecimento de infecções, contribuindo para a sobrevivência das bactérias no interior de fagócitos. O genoma da cepa PAO1 de <i>Pseudomonas aeruginosa</i> apresenta três loci que codificam aparatos de SST6, denominados de H1-SST6, H2-SST6 e H3-SST6, Porém, pouco se sabe sobre a participação do SST6 na patogênese de infecções por <i>P. aeruginosa</i>. Assim, o presente estudo investigou o papel de H1-SST6, H2-SST6 e H3-SST6 durante a infecção pulmonar aguda de camundongos. Para isso, camundongos C57/BL6 foram infectados com diferentes doses de bactérias da cepa selvagem PAO1 ou das cepas mutantes PAO1&#8710;H1, PAO1&#8710;H2, PAO1&#8710;H3 ou PAO1&#8710;H1&#8710;H2&#8710;H3. Após 24 horas, os lavados broncoalveolares (LBAs) de animais controle e infectados foram recuperados para a contagem de leucócitos totais e polimorfonucleares e para a quantificação, por ELISA, da quimiocina para neutrófilos, KC, e das citocinas pró-inflamatórias IL-1&#946; e TNF-&#945;. Em outros experimentos, os pulmões, fígados, baços e rins dos animais foram macerados para a pesquisa da carga bacteriana e da disseminação sistêmica das bactérias. A citotoxicidade do SST6 foi determinada, <i>in vitro</i>, em neutrófilos humanos, pela marcação com iodeto de propídeo (PI) e anexina-V seguida da análise em citometria de fluxo. Os resultados mostraram que a inativação dos três SST6 reduziu significativamente a concentração de neutrófilos nos LBAs quando os animais foram infectados com 10<SUP>7</SUP> Unidades Formadoras de Colônias de <i>P. aeruginosa</i>. Nesta dose, foi observado que as medianas do número de bactérias detectadas nos animais infectados com as mutantes no SST6 foram menores do que as detectadas nos animais infectados com a cepa parental PAO1. As mutações no SST6 não afetaram a disseminação sistêmica da bactéria. A pesquisa da secreção de citocinas pró-inflamatórias mostrou que, embora tenha sido observada uma redução nas medianas das concentrações de TNF-&#945; nos LBAs de camundongos infectados com a cepa PAO1&#8710;H1&#8710;H2&#8710;H3, em relação aos LBAs de camundongos infectados com a cepa parental, essa diferença não foi significativa. Como a pesquisa de IL-1&#946; e KC não contribuiu para a elucidação dos mecanismos envolvidos na redução da concentração de neutrófilos nos LBAs dos camundongos infectados pela cepa tripla mutante, foi pesquisado o possível efeito do SST6 na morte de neutrófilos humanos. Os resultados mostraram que não houve diferenças significativas quando as diferentes amostras de células infectadas foram comparedas entre si. Em conclusão, os resultados do presente estudo mostraram que o SST6 pode interferir na resposta de neutrófilos durante a pneumonia aguda, mas estudos adicionais são necessários para determinar o papel deste mecanismo de secreção na patogênese de <i>P. aeruginosa</i>.

ExoU, uma proteína do sistema de secreção do tipo III de Pseudomonas aeruginosa, induz a secreção de eicosanóides por células epiteliais respiratórias. Papel dos corpúsculos lipídicos neste processo

Para pesquisar o papel de ExoU no desencadeamento de resposta inflamatória nas vias aéreas, células epiteliais respiratórias humanas (CERs) da linhagem BEAS-2B foram tratadas com AA radiomarcado e infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa, que secreta ExoU, e com os mutantes PA103&#61508;exoU (com deleção do gene exoU), PA103&#916;UT/exoU (com deleção de exoU e complementação com o gene funcional) e PA103&#61508;UT/S142A (com deleção de exoU e complementação com gene com mutagênese sítio-específica no domínio catalítico da enzima). Após 1 hora, a liberação de AA pelas culturas infectadas com as cepas produtoras de ExoU foi significativamente superior à observada em culturas infectadas pelas cepas não-produtoras ou por células controle. O tratamento das bactérias com MAFP, um inibidor de PLA2, resultou em significativa redução na liberação de AA. Células infectadas pelas cepas PA103 e PA103&#916;UT/exoU secretaram PGE2 e LTB4 em concentrações significativamente maiores que as secretadas por células infectadas pelas demais cepas ou não infectadas. O tratamento com o MAFP reduziu significativamente a secreção de PGE2. A análise, por citometria de fluxo, de células infectadas e não infectadas tratadas com anticorpo anti-COX-2 mostrou que o percentual de células infectadas por PA103 marcadas foi significativamente superior ao percentual encontrado em culturas controle. Nenhuma diferença foi observada quanto ao percentual de células marcadas em culturas infectadas por PA103&#916;exoU. O tratamento das culturas com NS-398 (um inibidor seletivo de COX-2) resultou na diminuição significativa da concentração de PGE2, secretada por células infectadas com PA103, mas não por células infectadas com PA103&#916;exoU ou por células controle. Corpúsculos lipídicos (CLs) são domínios citoplasmáticos ricos em COX-2 e outras enzimas responsáveis pelo metabolismo do AA, sede da produção de eicosanóides. Como células infectadas pelas cepas produtoras de ExoU liberam AA livre, formulamos a hipótese de que a maior produção de eicosanóides por estas células seria dependente da indução do aumento no número dos CLs. No entanto, a análise por citometria de fluxo de células tratadas com uma sonda lipofílica com afinidade com os CLs mostrou que o percentual de células marcadas em culturas infectadas pelas cepas produtoras de ExoU foi significativamente inferior ao percentual em culturas controle ou infectadas pelas outras 2 cepas bacterianas. O tratamento das células com MAFP inibiu significativamente a redução do percentual de células contendo CLs. A análise, por citometria de fluxo, de células controle ou infectadas tratadas simultaneamente com a sonda lipofílica e com o anticorpo anti-PGE2, mostrou, em células infectadas com PA103, a redução da mediana da intensidade de marcação com a sonda lipofílica e o aumento da mediana da intensidade de marcação com o anticorpo anti-PGE2. Nossa hipótese é que a presença de ExoU nas células infectadas com a cepa PA103 resulte no metabolismo de glicerofosfolipídios presente nos CLs levando à diminuição da afinidade dos CLs pela sonda lipofílica e à síntese local de PGE2.

Potencial antiinflamatório do extrato aquoso de Echinodorus macrophyllus e de suas frações em modelo de inflamação aguda

A Echinodorus macrophyllus (Alismataceae), conhecida como chapéu de couro no Brasil, é usada popularmente para tratar doenças reumáticas e inflamatórias. Neste trabalho, foram avaliados os efeitos antiinflamatórios do extrato aquoso de E. macrophyllus (EAEm) e suas frações etanólicas no modelo murino de air pouch. Para a obtenção das frações, 7 g do EAEm foram aplicadas em uma coluna cromatográfica aberta de sílica gel eluída com diferentes concentrações de etanol. Os cromatogramas do EAEm/frações foram obtidos usando um sistema de HPLC. Foram obtidas quatro frações, duas delas com maior rendimento. Resumidamente, a bolha de ar foi induzida pela injeção de 5 mL de ar estéril (s.c) no dorso de camundongos SW machos (25-35 g). Após 3 dias, mas 3 mL de ar estéril foram injetados para manter a bolha. No sexto dia, cada grupo (n = 4) foi tratado intraperitoneal (ip) ou oralmente (v.o) com EAEm (25 ou 250 mg/kg), Fr20 ou Fr40 (2,5, 25, 50 ou 100 mg/kg) e os controles com indometacina (10 mg/kg, v.o.) ou veículo (salina). Uma hora depois, 1 mL de salina ou de carragenina 1% estéril foi injetada dentro da bolha. Após 4 h, a cavidade foi lavada com NaCl 0,9%, EDTA 2 mM (1 mL), para a determinação do número de leucócitos, volume do exsudato e concentração de proteínas. Células do exsudato foram preparadas em citocentrífuga e coradas pelo método do Panótico para a contagem diferencial dos leucócitos. Cortes histológicos coletados dos diferentes grupos foram fixados com formol tamponado 10% (pH 7,4) por 7 dias, corados com HE e analisados em MO. A análise da expressão da iNOS e da COX-2 foi realizada em células do exsudato por RT-PCR. O acúmulo de nitrito (NO2&#8722;) no sobrenadante do cultivo de células RAW 264.7 foi determinado usando um ensaio colorimétrico baseado na reação de Griess. Os resultados foram expressos como média EP e comparados usando ANOVA seguido de teste de Dunnet. Os experimentos foram realizados em triplicata. No modelo air pouch, a injeção de carragenina 1% aumentou tanto a migração celular quanto a concentração de proteína no exsudato. Contudo, enquanto o pré-tratamento com a Fr40 aumentou a resposta inflamatória, o pré-tratamento com o EAEm e a Fr20, sobretudo por via i.p., inibiu esta resposta quando comparado ao grupo controle tratado apenas com o veículo. Assim, foram observadas as seguintes razões de inibição da migração de células: EAEm, i.p. a 25 mg/kg (66,44%) e a 250 mg/kg (87,27%) e Fr20 a 2,5 mg/kg (26,89%), 25 mg/kg (60,06%), 50 mg/kg (63,13%) e a 100 mg/kg (77,47%). Em relação à contagem diferencial, o EAEm e a Fr20 afetaram principalmente o número de neutrófilos, inibindo sua migração no exsudato. O EAEm e a Fr20 também reduziram a concentração total de proteínas no exsudato principalmente no tratamento i.p.; EAEm a 25 e 250 mg/kg mostrou 3,33 0,55 e 2,05 0,51 mg/mL, respectivamente, quando comparado aos grupos controles (Indometacina 2.88 0.64 mg/mL; Veículo 5.48 0.88 mg/mL). A Fr20 a 2,5, 25, 50 e 100 mg/kg mostrou 4,788 0,444, 1,417 0,519, 2,474 0,529 e 2,215 0, 361 mg/mL. A análise histológica mostrou infiltrado celular, principalmente composto de leucócitos polimorfonucleares ao longo da derme inflamada de animais tratados com veículo. O tratamento com o EAEm ou Fr20 reduziu a infiltração de leucócitos no tecido inflamado. Além disso, o tratamento com o EAEm e a Fr20 mostrou atividade supressora sobre a expressão de iNOS e COX-2, e mostrou efeitos inibitórios na produção de NO induzida por LPS. Concluindo, todos estes resultados confirmam o potencial antiinflamatório sugerido para esta planta e fornecem uma base para a compreensão de seus mecanismos moleculares de ação. Contudo, outros estudos devem ser realizados para melhor elucidar as vias pelas quais o EAEm e a Fr20 exercem seus efeitos antiinflamatórios. Além disso, estudos fitoquímicos devem ser realizados para identificar os compostos ativos no EAEm e na Fr20.

Avaliação do estado nutricional de pacientes com doença inflamatória intestinal

A doença Inflamatória Intestinal (DII) é uma desordem caracterizada pela inflamação crônica do trato gastrointestinal. Os dois principais tipos de DII são a Retocolite Ulcerativa (RCU) e a Doença de Crohn (DC) e ambas cursam com importantes alterações no estado nutricional (EN). O objetivo deste estudo foi identificar as diferenças na composição corporal entre pacientes com DC, RCU e indivíduos saudáveis, além de comparar o estado nutricional dos três grupos de pacientes, ajustando para fatores que podem interferir no EN, como o uso atual de corticosteróides, a atividade física, a atividade de doença, a idade e o sexo. Foi realizado um estudo transversal que incluiu 101 pacientes com DII (50 com DC e 51 com RCU) e 35 indivíduos saudáveis, selecionados no Ambulatório do Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE) da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ). Foram colhidas informações sócio-demográficas e pessoais, tais como: prática de atividade física, tabagismo, doenças pregressas e procedimentos cirúrgicos prévios. Outras informações necessárias à pesquisa foram coletadas em prontuário médico. A avaliação antropométrica foi realizada por meio das seguintes medidas: peso corporal; altura; circunferências do braço, da cintura (CC) e do quadril; dobras cutâneas do tríceps, subescápula, supra-ilíaca e da coxa; e circunferência muscular do braço (CMB). A análise da composição corporal foi realizada por meio da bioimpedância elétrica (BIA), utilizando-se o aparelho Biodynamics modelo 450. As variáveis laboratoriais analisadas foram: glicose, hemograma completo, perfil lipídico, proteínas totais, albumina, globulina, velocidade de hemossedimentação e proteína C reativa. O peso, o índice de massa corporal, a CC e o percentual de gordura corporal calculado a partir da aferição das dobras cutâneas, foram menores nos pacientes com DC, quando comparados aos indivíduos saudáveis e/ou aos pacientes com RCU. A CMB foi menor nos pacientes com DC e RCU quando comparados aos indivíduos saudáveis, porém sem apresentar diferenças entre os dois grupos de pacientes. Por BIA, verificou-se que os pacientes com DC apresentaram valores de massa magra, massa celular corpórea, massa extracelular, água corporal total e água extracelular menores quando comparados aos indivíduos saudáveis. Os níveis séricos de colesterol total, proteínas totais e albumina, e a contagem total de hemácias foram menores nos indivíduos com DC quando comparados aos indivíduos do grupo controle e/ou aos indivíduos do grupo da RCU. Os pacientes com RCU exibem composição corporal semelhante à da população saudável. Em contraposição, os pacientes com DC apresentam EN amplamente comprometido com depleção de gordura corporal e massa magra em relação aos demais indivíduos

Efeito da deficiência de tiamina sobre a inflamação, estresse oxidante e migração celular em modelo experimental de sepse

A sepse é uma condição de elevada letalidade muito frequente em pacientes graves e pode estar associada à deficiência de vitamina B1 ou tiamina. Sendo a tiamina fundamental para produção de energia, restauração do poder redutor e síntese de ribose e desoxirribose celulares, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da deficiência de tiamina sobre a resposta inflamatória, através da medida de interleucinas, o estresse oxidante, pela determinação do 4-hidróxi 2-nonenal (4-HNE) um produto de peroxidação de lipídeos de membrana e a migração celular em modelo experimental de sepse. Em um primeiro experimento foi determinada a concentração de pirofosfato de tiamina (PPT) no sangue de camundongos c57bl6 alimentados com ração completa e com ração deficiente em tiamina, para determinação do tempo necessário para a indução de deficiência dessa vitamina. Em um segundo experimento foi utilizada a ligadura e perfuração cecal (CLP) como modelo de sepse em quatro grupos: SHAM ração completa, SHAM ração deficiente em tiamina, CLP ração completa, CLP ração deficiente em tiamina. As concentrações de PPT no sangue foram determinadas por cromatografia líquida de alta eficiência. As dosagens séricas e no líquido peritoneal de TNF-&#945;, IL-1&#946;, IL-6, KC e MCP-1/CCL2 foram realizadas por ELISA. O nível de 4-hidroxi,2-nonenal (4-HNE) no fígado foi avaliado por Western Blot. Contagem de leucócitos no sangue e no líquido peritoneal foi feita por microscopia óptica. Foi avaliada a concentração de bactérias no líquido peritoneal. Nos animais alimentados com ração completa a concentração média de PPT foi 303 42,6 nM, e a deficiência de tiamina foi induzida após 10 dias de ingestão da ração pobre em tiamina, quando observou-se concentração de 12,5 2,4 nM. No lavado peritoneal dos animais submetidos à CLP e privados de tiamina observou-se nível significativamente maior de TNF-&#945; e MCP-1. A IL-1&#946; foi menor no sangue do mesmo grupo. A expressão de 4-HNE foi maior nos grupos privados de tiamina. Quanto à celularidade sanguínea, observou-se apenas maior contagem de mononucleares no grupo submetido à CLP e privado de tiamina. No líquido peritoneal, a contagem de leucócitos totais, mononuleares e monócitos foi mais elevada nos grupos CLP, mas sem relação com o tipo de dieta. No entanto, no líquido peritoneal o grupo CLP deficiente em tiamina revelou população bacteriana significativamente menor que o grupo alimentado com ração completa e os grupos sham. Concluiu-se que a deficiência de tiamina associou-se com aumento da morte bacteriana na cavidade peritoneal, aumento do estresse oxidante, e mudanças na resposta inflamatória. Palavras-chave: Tiamina. Sepse. Estresse oxidante. Inflamação. Modelo de sepse.A sepse é uma condição de elevada letalidade muito frequente em pacientes graves e pode estar associada à deficiência de vitamina B1 ou tiamina. Sendo a tiamina fundamental para produção de energia, restauração do poder redutor e síntese de ribose e desoxirribose celulares, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da deficiência de tiamina sobre a resposta inflamatória, através da medida de interleucinas, o estresse oxidante, pela determinação do 4-hidróxi 2-nonenal (4-HNE) um produto de peroxidação de lipídeos de membrana e a migração celular em modelo experimental de sepse. Em um primeiro experimento foi determinada a concentração de pirofosfato de tiamina (PPT) no sangue de camundongos c57bl6 alimentados com ração completa e com ração deficiente em tiamina, para determinação do tempo necessário para a indução de deficiência dessa vitamina. Em um segundo experimento foi utilizada a ligadura e perfuração cecal (CLP) como modelo de sepse em quatro grupos: SHAM ração completa, SHAM ração deficiente em tiamina, CLP ração completa, CLP ração deficiente em tiamina. As concentrações de PPT no sangue foram determinadas por cromatografia líquida de alta eficiência. As dosagens séricas e no líquido peritoneal de TNF-&#945;, IL-1&#946;, IL-6, KC e MCP-1/CCL2 foram realizadas por ELISA. O nível de 4-hidroxi,2-nonenal (4-HNE) no fígado foi avaliado por Western Blot. Contagem de leucócitos no sangue e no líquido peritoneal foi feita por microscopia óptica. Foi avaliada a concentração de bactérias no líquido peritoneal. Nos animais alimentados com ração completa a concentração média de PPT foi 303 42,6 nM, e a deficiência de tiamina foi induzida após 10 dias de ingestão da ração pobre em tiamina, quando observou-se concentração de 12,5 2,4 nM. No lavado peritoneal dos animais submetidos à CLP e privados de tiamina observou-se nível significativamente maior de TNF-&#945; e MCP-1. A IL-1&#946; foi menor no sangue do mesmo grupo. A expressão de 4-HNE foi maior nos grupos privados de tiamina. Quanto à celularidade sanguínea, observou-se apenas maior contagem de mononucleares no grupo submetido à CLP e privado de tiamina. No líquido peritoneal, a contagem de leucócitos totais, mononuleares e monócitos foi mais elevada nos grupos CLP, mas sem relação com o tipo de dieta. No entanto, no líquido peritoneal o grupo CLP deficiente em tiamina revelou população bacteriana significativamente menor que o grupo alimentado com ração completa e os grupos sham. Concluiu-se que a deficiência de tiamina associou-se com aumento da morte bacteriana na cavidade peritoneal, aumento do estresse oxidante, e mudanças na resposta inflamatória.